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Différenciation et polarité cellulaire
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Mots-clés :.Arabidopsis thaliana, Camelina sativa, Développement de l'embryon, Tissus vasculaires, Polarité cellulaire, Dynamic membranaire, micro-domaines, Acide gras, Sphingolipides

Ecole(s) doctorale(s) de rattachement : Sciences du végétal (ParisXI Orsay)
Domaines de recherche et d'expertise :Génétique, Biologie Moléculaire, Biologie cellulaire et imagerie, Biologie du développement, Biochimie des lipides

Contacts :

Institut Jean-Pierre Bourgin, UMR1318 INRA-AgroParisTech
Bâtiment 2
INRA Centre de Versailles-Grignon
Route de St-Cyr (RD10)
78026 Versailles Cedex France

tél : +33 (0)1 30 83 30 00 - fax : +33 (0)1 30 83 33 19


Responsable
Jean-Denis Faure

Professeur AgroParisTech


Jean-Christophe Palauqui
Chargé de Recherche INRA
Ontogenèse du phloème, polarité cellulaire, phénotypage cellulaire de la plante entière, microdissection laser.

Yannick Bellec
Technicien INRA
Analyse génétique et moléculaire de mutants et de plantes transgéniques d'Arabidopsis, analyse des bases sphingoïdes

Julien Barthelemy
Technicien INRA
Analyse cytologiques, physiologiques, génétiques et moléculaires de mutants et de plantes transgéniques, phénotypage cellulaire à l'iodure de propidium.

Belsem Belkhiria
Master 2
du 4/11/13 au 31/12/13 & du 1/3/14 au 30/6/14

Belsem.Belkhiria@versailles.inra.fr

 

Anciens membres
de l'équipe

Kian Hématy
Chargé de recherche

Lionel Gissot
Ingénieur de recherche INRA
Polarité cellulaire, dynamique endomembranaire, interaction protéine-protéine (FRET, BiFC); localisation subcellulaire de marqueurs GFP,

Pauline Anne
Doctorant
du 01/10/11 au 30/09/14


Céline Morineau
Doctorant
du 01/10/11 au 30/09/14

Elise Laruelle
Doctorant
du 1/11/13 au 31/10/16

Elise.Laruelle@versailles.inra.fr

 

Photo de l'équipe

Résumé :

À la différence du règne animal, les cellules végétales ne sont pas capables de migrer, ainsi la signalisation intercellulaire et l’acquisition d’une polarité cellulaire jouent un rôle prépondérant pour définir la position et l’identité d’un tissu. Les informations de position tel que les gradients hormonaux ou métaboliques, le transport intercellulaire de facteurs de transcriptions, ou le stress mécanique sont directement ou indirectement liés à une activité membranaire (récepteur, transporteur, canal, plasmodesme).  Cette activité membranaire peut elle-même être spatialement régulée par  une distribution différentielle de marqueurs ou de structures membranaires (membrane plasmique ou endomembranes) qui conduit à une orientation morphologique et fonctionnelle préférentielle de la cellule définissant ainsi la polarité cellulaire. Dans le cas du transport d'auxine, différenciation et polarité cellulaire sont directement couplées.  De récentes études effectuées sur (1) le rôle de la composition lipidique de la membrane plasmique,  (2) le trafic endomembranaire et (3) le déterminisme de la polarité cellulaire permettent de mieux appréhender comment la structure de certains lipides modifient la structure et la dynamique des membranes. Dans ce contexte, notre équipe se focalise sur deux questions principales: (i) Quels sont les mécanismes cellulaires et subcellulaires, en particulier ceux impliquant les lipides membranaires, qui contrôlent la polarité cellulaire et (ii) Comment la différenciation cellulaire se détermine au travers de la polarité cellulaire?


Résultats marquants :


Rôles des lipides dans la prolifération et la différenciation cellulaire
(Y Bellec, L Gissot, K Hematy, JD Faure). Nous avons identifié plusieurs mutants (pasticcino, pas) affectés dans l’élongation des acides gras qui conduisent à des proliférations cellulaires,de type tumoral, et à des altérations de  l’organisation tissulaire (Faure et al. 1998; Vittorioso et al. 1998; Bellec et al. 2002; Baud et al. 2004; Bach et al. 2008) (Fig.1). La diminution des acides gras à très longues chaînes (VLCFAs) chez ces mutants touche principalement les triglycérides de réserves des graines, les cires épicuticulaires et les sphingolipides. Cette réduction conduit à des défauts de polarité cellulaire .  notamment  dans les mutants pas1 et pas3, où la modification de la distribution de PIN1 altère le transport polaire d'auxine durant l’embryogenèse et la formation des racines latérales (Roudier et al., 2010). Parmi les différents lipides constitués de VLCFAs, les sphingolipides sont connus pour être impliqués dans le trafic membranaire et la polarité cellulaire. L'analyse fonctionnelle d’une famille clé de la voie de biosynthèse des sphingolipides chez Arabidopsis (les céramides synthases) a montré que seules  les très longues chaînes d'acide gras (C > 18 carbones) des sphingolipides sont indispensables au développement. Leur diminution altère l'adressage spécifique de certains transporteurs polaire d'auxine à la membrane plasmique conduisant à un blocage de l'émergence des racines latérales (Markham et al., 2011).

 

jpgLongueur des chaînes d'acides gras et dynamique membranaire (L Gissot, K Hematy, JD Faure).  La longueur des chaînes acylés est susceptible de modifier les propriétés des membranes en particulier durant la division cellulaire où un intense trafic endomembranaire est nécessaire. Une réduction globale des VLCFAs réduit en effet l'expansion de la plaque cellulaire et modifie la structure de certains compartiments endomembranaires (Bach et al., 2011). L'inhibition de la synthèse des sphingolipides à très longues chaînes altère aussi la cytokinèse en modifiant les propriétés structurales des endosomes (augmentation du temps de rétention de certains marqueurs, et de structures endosomales) suggérant des défauts de fusion membranaire.. En utilisant des liposomes artificiels, nous avons pu démontrer que la longueur des chaînes d'acide gras des sphingolipides neutre glucosylceramide étaient directement impliqués dans la fusion membranaire (Molino et al. in prep.).

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OPS contrôle la différenciation vasculaire (JC Palauqui, P Anne). La différenciation vasculaire est associée au contexte de développement de chaque organe et peut être divisée en différentes étapes consécutives incluant la mise en place des cellules initiales suivit de la différenciation des différents types cellulaires (phloème et xylème). Seulement quelques déterminants génétiques de la différenciation du phloème ont été caractérisés jusqu'à présent. Nous avons identifié OCTOPUS (OPS) comme un régulateur potentiel de la différenciation du phloème (Truernit et al., 2012). OPS est une protéine membranaire avec une distribution polaire qui est initialement exprimée dans les cellules provasculaires et dont l'expression se restreint à la lignée phloémienne au cours de la spécification des tissus vasculaires. Les mutants ops montrent une différenciation phloèmienne discontinue suggérant que OPS intègrerait une information de position longitudinale permettant aux cellules des initiales d'acquérir l'identité de protophloème.

 

 

Développement de nouveaux outils et méthodes
Sphingolipidomique. Nous avons d'abord développé une méthode rapide et sensible d'analyse des bases à longues chaînes (LCB) par HPLC couplée à une détection par fluorescence validée dans de nombreuses études (Bach et al., 2008; Lachaud et al., 2009, 2010; Melser et al., 2010; Roudier et al., 2010; Aubert et al., 2011; Bach et al., 2011; Markham et al., 2011).
Nous avons aussi mis en place une méthode simplifiée de spectrométrie de mas (LC-MS/MS) avec une seule injection pour caractériser et quantifier plus de 350 type of sphingolipides (Tellier et al. Submitted).

Imagerie tridimensionnelle et à haute résolution de l'organisation cellulaire et de l'expression génique dans des tissus entiers.Une méthode originale de coloration a été développée pour imager tout type de tissus végétal. Cette méthode permet un phénotypage à l'échelle cellulaire ainsi que la modélisation spatiale des tissus mais aussi la visualisation de l'expression génique avec des gènes rapporteurs GUS (Truernit et al., 2008; Truernit and Palauqui, 2009; Wuyts et al., 2010).

Microdissection assistée par laser des ARNs et des lipides. Dans le cadre du projet ANR génoplante "REGENEOME" nous avons développé la microdissection assistée par laser (LAM) pour l'analyse transcriptome et de la structure chromatinienne de types cellulaires spécifiques isolés à différentes étapes du processus de régénération. Nous adaptons cet outil aussi pour cartographier différents lipides dans les tissus végétaux.

 

jpg

Interaction protéine-protéine dans des cellules vivantes. Dans le contexte du projet européen AGRON-OMICS (http://www.agron-omics.eu/), nous avons participé à la validation de réseaux d'interaction protéiques et développé des méthodes d'analyse des interactions protéine-protéine  in vivo grâce aux méthodologies "split-reporter" tel que Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) ou split luciférase. Nous avons aussi mis au point un protocole optimisé (optimized protocol – utiliser le lien internet cf version anglaise) pour l'expression transitoire dans des plantules d'Arabidopsis. Cette méthode permet de déterminer la distribution subcellulaire de protéines mais aussi leurs interactions (Marion et al. 2008). Ces approches ont été utilisées dans de nombreuses études (Bach et al., 2008; Marion et al., 2008; Roudier et al., 2010; Van Leene et al., 2010; Markham et al., 2011; Bernard et al., 2012).
Pour visualiser des interactions protéiques de manière plus dynamique, nous sommes actuellement en cours de développement de la technique d'anisotropie de fluorescence par microscopie confocale.



jpgRecherche translationnelle. La recherche sur la biosynthèse et le rôle des VLCFAs et des sphingolipides chez Arabidopsis a conduit à la production de plusieurs lignées potentiellement intéressantes pour améliorer le rendement et la qualité des huiles végétales. Pour valider ses résultats, nous utilisons Camelina sativa ou cameline, une Brassicacae caractérisé pour la qualité de son huile (riche en omega-3), ses caractéristiques agronomiques mais surtout pour sa facilité à être transformé génétiquement et à extraire son huile. Nous développons de nouveaux vecteurs de transformation plus adaptés et nous améliorons la méthode de transformation. Le fait que cameline montre une faible capacité à se croiser avec des espèces sauvages voisines est un avantage pour tester de nouveaux caractères dans cette espèce   à la fois en serre et aux champs (Julie-Galau et al. 2013).



Projets en cours  (Projets de Master et de thèse sont disponibles, post-doc possible - rejoignez nous!)

a) Analyse fonctionnelle d'OPS au cours du développement (P Anne, JC Palauqui). Le projet se focalise sur la famille OPS et leurs interacteurs protéiques.

b) Rôle des lipides dans la différenciation cellulaire : approches génétiques (Y Bellec, L Gissot, K Hematy, C Morineau). De nouveaux cribles génétiques chez Arabidopsis et la levure sont actuellement en cours pour décrypter le réseau de régulation associé avec l'élongation des acides gras.

c) Rôles structuraux des lipides dans la formation des microdomaines membranaires (K Hematy).

jpg De nombreuses études ont montré que la membrane plasmique était bien plus hétérogène et organisé que ce qui était initialement proposé. La membrane s'organise en structures hétérogènes allant de macrodomaines (échelle du micromètre) aux microdomaines (échelle du nanomètre). La distribution de marqueurs spécifiques des macro- et micro-domaines dans des contextes de mutants lipidiques a montré que les stérols et les VLCFA sont des éléments structurant de ces domaines. La combinaison d'approches de génétique moléculaire, de chimie des lipides, d'imagerie et de biophysique sont maintenant utilisés pour comprendre comment ces différentes catégories de lipides  impactent l'organisation et les nombreuses fonctions de la membrane plasmique.

jpgd) De l'asymétrie cellulaire à l'organisation tissulaire (JC Palauqui). Dans le but de comprendre comment l'orientation de la cellule mais aussi son organisation subcellulaire est intégrée dans l'organogénèse tissulaire, nous avons développé une approche multiéchelle décrivant les premières étapes du développement embryonnaire. Les dynamiques des divisions cellulaires dans l'espace et le temps dans le jeune embryon permet de construire un modèle ou les caractéristiques géométriques de la cellule permettent de prédire l'orientation de la prochaine division et de définir l'identité des nouvelles cellules (Moukhtar et al., in preparation). L'objectif sera d'intégrer différents composants intracellulaires (lipides, cytosquelette,transport d’auxine…) dans un modèle 4D pour évaluer le rôle de la polarité cellulaire dans l'organisation du jeune embryon.

e) Biosynthèse des lipides, complexes enzymatiques et qualité de l'huile (Y Bellec, L Gissot, JD Faure). L'existence de nombreuses interactions protéine-protéines au sein des enzymes de biosynthèse des lipides ainsi que la découverte du rôle de l'immunophilin PAS1 comme chaperonne potentielle du complexe élongase (Roudier et al. 2010) suggèrent l'existence d'une organisation supramoléculaire dans le réticulum endoplasmique (metabolon). Déterminer les différentes interactions moléculaires au sein des voies de biosynthèses des lipides ainsi que leurs déterminants moléculaires permettra de fournir le canevas nécessaire pour modifier de façon ciblée ces différentes voies chez la cameline. L'objectif visé est ainsi d'améliorer la quantité et la qualité des lipides associés à l'huile en particulier pour des usages nutritionnels ou industriels.

 


Publications représentatives :

Aubert A, Marion J, Boulogne C, Bourge M, Abreu S, Bellec Y, Faure JD, Satiat-Jeunemaitre B (2011) Sphingolipids involvement in plant endomembrane differentiation: the BY2 case. Plant J 65: 958-971 (Pubmed)

Bach L, Gissot L, Marion J, Tellier F, Moreau P, Satiat-Jeunemaitre B, Palauqui JC, Napier JA, Faure JD (2011) Very-long-chain fatty acids are required for cell plate formation during cytokinesis in Arabidopsis thaliana. Journal of cell science 124: 3223-3234 (Pubmed)

Bach L, Michaelson L, Haslam R, Bellec Y, Gissot L, Marion J, Da Costa M, Boutin J-P, Miquel M, Tellier F, Domergue F, Markham J, Beaudoin F, Napier J, Faure J-D (2008) The plant very long chain hydroxy fatty Acyl-CoA dehydratase PASTICCINO2 is essential and limiting for plant development. Proc. Natl. Acad. USA 105: 14727-14731 .(Pubmed)

Baud S, Bellec Y, Miquel M, Bellini C, Caboche M, Lepiniec L, Faure JD, Rochat C (2004) gurke and pasticcino3 mutants affected in embryo development are impaired in acetyl-CoA carboxylase. EMBO Rep 5: 1-6 (PubMed)

Bernard A, Domergue F, Pascal S, Jetter R, Renne C, Faure JD, Haslam RP, Napier JA, Lessire R, Joubes J (2012) Reconstitution of Plant Alkane Biosynthesis in Yeast Demonstrates That Arabidopsis ECERIFERUM1 and ECERIFERUM3 Are Core Components of a Very-Long-Chain Alkane Synthesis Complex. The Plant cell 24: 3106-3118

Jolivet P, Acevedo F, Boulard C, d’Andrea S, Faure JD, Kohli A, Nesi N, Valot B, Chardot T (2013) Crop seed oil bodies: From challenges in protein identification to an emerging picture of the oil body proteome. Proteomics. doi: 10.1002/pmic.201200431

Julié-Galau S, Bellec Y, Faure J-D, Tepfer M (2013) Evaluation of the potential for interspecific hybridization between Camelina sativa and related wild Brassicaceae in anticipation of field trials of GM camelina. Transgenic research. doi: 10.1007/s11248-013-9722-7

Lachaud C, Da Silva D, Cotelle V, Thuleau P, Xiong TC, Jauneau A, Briere C, Graziana A, Bellec Y, Faure JD, Ranjeva R, Mazars C (2009) Nuclear calcium controls the apoptotic-like cell death induced by d-erythro-sphinganine in tobacco cells. Cell Calcium, 47, 1, 92-100 (Pubmed)

Marion J, Bach L, Bellec Y, Meyer C, Gissot L, Faure JD (2008) Systematic analysis of protein subcellular localization and interaction using high-throughput transient transformation of Arabidopsis seedlings. Plant J 56: 169-179 (Pubmed)

Markham JE, Molino D, Gissot L, Bellec Y, Hematy K, Marion J, Belcram K, Palauqui JC, Satiat-Jeunemaitre B, Faure JD (2011) Sphingolipids Containing Very-Long-Chain Fatty Acids Define a Secretory Pathway for Specific Polar Plasma Membrane Protein Targeting in Arabidopsis. Plant Cell 23: 2362-2378 (Pubmed)

Melser S, Batailler B, Peypelut M, Poujol C, Bellec Y, Wattelet-Boyer V, Maneta-Peyret L, Faure JD, Moreau P (2010) Glucosylceramide Biosynthesis is Involved in Golgi Morphology and Protein Secretion in Plant Cells. Traffic 11: 479-490 (Pubmed)

Roudier F, Gissot L, Beaudoin F, Haslam R, Michaelson L, Marion J, Molino D, Lima A, Bach L, Morin H, Tellier F, Palauqui JC, Bellec Y, Renne C, Miquel M, Dacosta M, Vignard J, Rochat C, Markham JE, Moreau P, Napier J, Faure JD (2010) Very-long-chain fatty acids are involved in polar auxin transport and developmental patterning in Arabidopsis. Plant Cell 22: 364-375 (pubmed)

Truernit E, Bauby H, Belcram K, Barthelemy J, Palauqui JC (2012) OCTOPUS, a polarly localised membrane-associated protein, regulates phloem differentiation entry in Arabidopsis thaliana. Development 139: 1306-1315

Truernit E, Bauby H, Dubreucq B, Grandjean O, Runions J, Barthelemy J, Palauqui JC (2008) High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of Phloem development and structure in Arabidopsis. Plant Cell 20: 1494-1503 (Pubmed)

Truernit E, Palauqui JC (2009) Looking deeper: whole-mount confocal imaging of plant tissue for the accurate study of inner tissue layers. Plant Signal Behav 4: 151-152

Van Leene J, Hollunder J, Eeckhout D, Persiau G, Van De Slijke E, Stals H, Van Isterdael G, Verkest A, Neirynck S, Buffel Y, De Bodt S, Maere S, Laukens K, Pharazyn A, Ferreira PC, Eloy N, Renne C, Meyer C, Faure JD, Steinbrenner J, Beynon J, Larkin JC, Van de Peer Y, Hilson P, Kuiper M, De Veylder L, Van Onckelen H, Inze D, Witters E, De Jaeger G (2010) Targeted interactomics reveals a complex core cell cycle machinery in Arabidopsis thaliana. Mol Syst Biol 6: 397

Wuyts N, Palauqui JC, Conejero G, Verdeil JL, Granier C, Massonnet C (2010) High-contrast three-dimensional imaging of the Arabidopsis leaf enables the analysis of cell dimensions in the epidermis and mesophyll. Plant Methods 6: 17

 

Autres publications

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