IJPB-Variabilité et tolérance aux stress abiotiques

Nous recherchons l’ensemble des gènes qui interviennent dans l’expression de la tolérance à ces stress. Pour cela, plusieurs approches sont mises en œuvre :

Concernant le déficit hydrique, nous avons déterminé les conditions d’un stress modéré pour obtenir une interaction dans la réponse des génotypes avec le traitement appliqué. Les plantes sont cultivées sur un substrat industriel horticole, en condition hydrique sub-optimale. Nous avons déterminé des caractères qui varient avec le génotype et avec les conditions hydriques, mesurés sur l’appareil végétatif ou sur l’appareil reproducteur.
Le stress osmotique est étudié en conditions de culture in vitro avec application d’osmoticum (PEG, mannitol) dont les concentrations sont ajustées de façon à obtenir des stress osmotiques modérés. L’effet sur la croissance de la jeune plante est utilisé comme un modèle de croissance cellulaire et d’intégration des signaux de l’environnement. Les QTL détectés à ce stade seront aussi étudiés individuellement en conditions de déficit hydrique (in vivo).

Parallèlement à ces approches de génétique quantitative, nous sommes impliqués dans un vaste programme de génomique visant à identifier des mutants dans des gènes sans aucune fonction connue, dits “orphelins”, altérés dans leur réponse à la sécheresse. Parmi une liste de mutants sélectionnés in silico, un criblage en masse nous a permis de retenir une quarantaine de lignées pour une analyse génétique et physiologique plus poussée. Si les gènes touchés sont validés quant à leur rôle dans la réponse au stress, alors une analyse fonctionnelle sera engagée.

L’équipe travaille sur les mécanismes impliqués dans la tolérance au froid, principalement sur la plante modèle A. thaliana (résistance ou sensibilité).
Certains mécanismes permettant aux plantes de survivre à une température gélive ont été partiellement élucidés ces dernières années, en particulier de nombreuses études sur le phénomène d’acclimatation ont permis d’identifier des voies de réponse, notamment la voie CBF. Par contre les résultats d’analyses de transcriptome suggèrent que d’autres voies existent et restent à caractériser.
Plusieurs approches sont donc mises en œuvre dans l’équipe pour identifier de nouveaux gènes impliqués dans ces voies.
Une première approche consiste à s’appuyer sur la variabilité naturelle disponible afin de caractériser des accessions de tolérance variable et d’initier à partir de ces données, par utilisation des lignées RIL disponibles au Centre de Ressources, une recherche de QTL qui devrait permettre l’identification de nouveaux gènes. 8 accessions de la core collection présentant des degrés de tolérance contrastés ont été caractérisées dans cet objectif.
Parallèlement à ces approches génétiques quantitatives, nous sommes également impliqués dans le programme de génomique visant à identifier des mutants dans des gènes sans aucune fonction connue, dits “orphelins”. Nous recherchons des mutants altérés dans la réponse au froid. Parmi une liste de mutants sélectionnés in silico, un criblage en masse nous a permis de retenir environ 80 lignées pour une analyse génétique et physiologique plus poussée. Les gènes candidats, après validation, feront l’objet d’une analyse fonctionnelle.
Enfin nous étudions la variabilité naturelle pour la famille des gènes CBF. L’approche consiste à rechercher des corrélations entre la variabilité des séquences nucléotidiques, la variabilité au plan de l’expression (analysée par RT-PCR quantitative) et la variabilité phénotypique. Un groupe d’accessions de la core collection a été caractérisé pour cet ensemble de paramètres. De plus nous avons utilisé une approche ARNi pour inactiver l’ensemble des membres de la famille dans quelques accessions. Cet ensemble de données devrait permettre d’évaluer l’importance de la voie CBF chez les différentes accessions et d’identifier des allèles particulièrement favorables. Enfin, nous nous intéressons au fonctionnement de la famille des gènes CBF (rôle de chaque membre, redondance éventuelle...) sous l’angle évolutif. Ces gènes sont en effet retrouvés chez de nombreux angiospermes et semblent constituer une voie assez conservée.

Toutes ces approches nécessitent un test phénotypique robuste.
Un test de tolérance au gel avec ou sans phase d’acclimatation a donc été mis au point dans l’équipe. Il se réalise sur plantes en terreau et en chambres climatisées descendant en températures < 0°C. Ce test est destructif pour les plantes les plus sensibles.
Pour les observations phénotypiques, l’équipe utilise une méthode de notation particulière basée sur l’évaluation visuelle de l’intensité des dégâts. Les notes s’étalent de 0 à 6 (0 étant l’absence de dégâts). Les notations sont faites pendant environ deux semaines, cela permet ainsi d’étudier l’évolution des plantes après le stress. (Protocole disponible sur demande)

Résultats obtenus

L’équipe a mis au point un test fiable et reproductible. En effet, les notes attribuées lors des observations phénotypiques sont homogènes, tout comme les résultats obtenus lors de différentes répétitions d’un même test.
Grâce à l’étude de la variabilité naturelle au sein de la core collection, l’équipe a réalisé un classement des écotypes en fonction de leur réponse au stress froid appliqué.
Sur les 48 écotypes testés au gel avec acclimatation, 4 se révèlent très sensibles dès –4°C et 4 très tolérants jusqu’à – 8°C (la liste est disponible auprès de l’équipe).
Les conditions définies pour le test phénotypique permettent de révéler une grande variabilité de réponse.
Une observation constante est que les plantes les plus jeunes présentent une meilleure tolérance au stress froid que les plus âgées. Parmi les accessions testées, aucune ne présente un comportement analogue au mutant eskimo (résistant sans acclimatation).
Lors de tests réalisés sur certains hybrides RxS, c'est-à-dire issus d’un croisement entre des écotypes résistants et des écotypes sensibles, les descendants testés apparaissent comme plutôt résistants au froid. Au contraire, lors de tests réalisés sur certains hybrides SxS, les descendants apparaissent sensibles au froid. Certains gènes de sensibilité au froid semblent donc communs à ces différents écotypes.
Aujourd’hui des tests sont en cours sur des plantes transgéniques RNAi portant une construction pour inactiver les gènes CBF. L’équipe travaille à vérifier l’efficacité des constructions RNAi et donc de l’inactivation des gènes CBF. Ces plantes serviront à étudier l’impact de l’inactivation des gènes CBF dans la réponse au froid des différents écotypes.

En parallèle, des analyses d’expression des gènes CBF sont en cours sur des écotypes présentant des types de réponse différents à l’application du stress.